基因/miRNA表達水平分析驗證
定量PCR（即時聚合酶鏈鎖反應，Real-time Polymerase Chain Reaction，簡稱 Real-time PCR、即時PCR），又稱定量即時聚合酶鏈鎖反應（Quantitative real time polymerase chain reaction，簡稱即時定量PCR）。定量PCR技術是指以外參或內參為標準，通過對PCR終產物的分析或PCR過程的監測，進行PCR起始模板量的定量。該技術可以準確的檢測基因的相對表達量和絕對表達量，被廣泛地應用與基因表達水平的研究。同時，它也作為一些組學技術的驗證，比如轉錄組測序、表達芯片等實驗結果驗證。
1. 技術重復質量評估分析；
2. Ct值計算
△Ct（Treated）= CT（Treated_gene A）-CT（Treated_housekeeping gene）
△Ct（Control）= CT（Control_gene A）-CT（Control_ housekeeping gene）
△△Ct=△Ct（Treated）-△Ct（Control）
3. 對于有生物學重復的檢測，計算SD和p-value。
與RT-PCR相比，熒光定量PCR具有以下技術優勢：
1、實時監測：通過擴增曲線能夠實時監測PCR產物的積累。
2、特異性強：實驗完成后，溶解曲線的分析可以驗證擴增產物的特異性，降低假陽性。
3、精確定量：利用擴增進入指數增長期的CT值來定量測定起始模板量，從而實現了極為精確的核酸定量檢測。
（一）樣品類型
1. 總RNA；樣品濃度：≥250 ng/ul；樣品總量：>5ug；樣品純度： OD260/280為1.8~2.2，OD260/230≥1.0，260nm處有正常峰值。RNA完整性： 電泳檢測28S/18S≥1.5。
2. 組織：樣品取樣后立即液氮速凍，保存于液氮或超低溫冰箱中。請盡量使用新制備的樣品且樣品量至少滿足3次以上提??；
（二）樣本運輸
1. 總RNA樣品請溶于RNase-free H2O或乙醇中，置于1.5 ml RNase-free離心管中，管上注明樣品名稱、濃度以及制備時間，管口使用Parafilm封口，干冰運輸；
2. 樣本取樣后置于凍存管中并標注，使用足量的干冰運輸，并且盡量選用較快的郵遞方式，以降低運輸過程中樣品降解的可能性。
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